변이된 GNE/MNK 유전자 도입으로 인한 CHO 세포 내 CMP-sialic acid 증가 = Enhancement of CMP-sialic acid pool in CHO cells by expressing sialuria-mutated GNE/MNK gene

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당화(glycosylation)는 진핵 세포에서 일어나는 번역 후 변형 과정(post-translational modification)에 있어서 가장 중요한 부분을 차지하고 있다. 당단백질의 당 구조는 당단백질의 특성에 많은 영향을 미치며 그 특성들에는 효소 활성, 면역성, 안정성, 약물 동태학, 단백질 분비, 체내 제거율 등이 있다. 당화는 크게 N-linked 당화와 O-linked 당화로 구분할 수 있고, 특정 폴리펩티드 위치에 당이 결합됨으로써 당화가 일어나게 된다. 당쇄 끝에는 시알산이 결합하게 되고, N-linked 당화의 경우 최대 4개, O-linked 당화의 경우 최대 2개의 시알산이 결합할 수 있다. N-linked glycan 의 시알산은 주로 당 단백질의 체내 제거율에 관여한다. 시알산이 결합되지 않은 당쇄는 간의 asialyglycoprotein receptor 에 의해 제거되나, 시알산이 결합되어 있는 당쇄는 이 receptor에 결합되지 않아 체내에서 오랫동안 유지된다. 따라서 당 단백질의 시알산을 증진시킴으로써 해당 당 단백질의 체내 반감기를 증가 시킬 수 있다. CMP-NeuNAc 는 시알산의 전구체로서 세포 내 CMP-NeuNAc pool 을 증진시킬 경우, 당 단백질의 시알산 증가를 기대할 수 있다. 그러나 세포 내 CMP-NeuNAc가 증가하면 음성되먹임억제(negative feedback inhibition) 작용으로 CMP-NeuNAc의 생합성 과정에 관여하는 UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase(GNE/MNK) 유전자의 epimerase 기능을 저해한다. Sialulria 라는 질병은 이러한 알로스테릭 저해 위치에 변이가 발생하여 CMP-NeuNAc 의 농도가 증가함에 따라 epimerase 의 활성이 저해 되지 않는다. 따라서 이러한 점 돌연변이를 포함한 GNE/MNK 유전자를 재조합 EPO 생산 CHO 세포에 도입하여 CHO 세포 내 CMP-NeuNAc pool 을 늘리고자 하였다. CHO 세포에 도입하기 전 rat GNE/MNK 유전자의 263번 아미노산 하나 또는 263번과 266번아미노산 두 개를 치환시켜 E.coli 에 도입하여 활성 저하를 측정하였다. Wild type GNE/MNK효소는 CMP-NeuNAc 양이 증가할수록 그 활성이 감소하여 CMP-NeuNAc 150mM의 농도에서는 활성이 수준으로 감소하였다. 반면 변이된 GNE/MNK 의 경우 CMP-NeuNAc 농도에 상관없이 일정한 활성을 유지하였다. 또한, 263번 아미노산 하나만 치환된 경우 wild type에 비해 활성 절대값이 62.30% 인데 반해, 263번과 266번 아미노산 두 개가 치환된 GNE/MNK 는 wild type과 유사한 수준의 활성값을 보였다. 활성을 확인한 변이된 GNE/MNK 유전자 두 가지를 인간 재조합 EPO 생산 CHO 세포에 각각 도입시켰다. Stable 세포주를 구축하고 이들 세포를 배양하여 세포 내 CMP-NeuNAc 를 추출해내어 그 농도를 측정하였다. 263번 아미노산 하나만 치환된 GNE/MNK 를 도입시킨 CHO 세포는 wild type CHO 세포에 비해 CMP-NeuNAc 의 양이 약 186% 증가하였으며, 263번과 266번 아미노산 두 개가 치환된 GNE/MNK 를 도입시킨 CHO 세포는 wild type 대비 약 1170%가 증가함을 확인하였다. 구축한 세포주들로부터 EPO 를 생산하여, EPO 의 시알산을 측정하였다. Wild type 의 CHO 세포와 비교하여 시알산이 증가하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 EPO의 시알산 증가를 위해서는 전구체인 CMP-NeuNAc 의 증가뿐만 아니라, 세포 내 CMP-NeuNAc 가 시알산으로 변형되고 이용되기 위해 필요한 CMP-NeuNAc transporter 와 sialyltransferase 등의 여러 유전자의 동시 도입이 요구된다.
Advisors
김정회researcherKim, Jung-Hoeresearcher
Description
한국과학기술원 : 생명과학과,
Publisher
한국과학기술원
Issue Date
2010
Identifier
419023/325007  / 020088068
Language
kor
Description

학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명과학과, 2010.2, [ vii, 47 p. ]

Keywords

에리스로포이어틴; 중국 햄스터 난소세포; CMP-시알산; UDP-GlcNAc 2-에피머라제; 시알산화; sialylation; erythropoietin; CHO; CMP-sialic acid; GNE

URI
http://hdl.handle.net/10203/28109
Link
http://library.kaist.ac.kr/search/detail/view.do?bibCtrlNo=419023&flag=dissertation
Appears in Collection
BS-Theses_Master(석사논문)
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