CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법

Abstract

본 발명은 (a) 정상 박테리아를 온도 민감성 또는 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (e) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터 및 제1벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.본 발명에 따른 방법은 타겟 유전자를 효과적으로 결실시키고, 재조합된 미생물을 신속하게 그리고 높은 효율로 선별할 수 있으며, 또한, 최종적으로 선별된 재조합 미생물 내에 외래 벡터를 모두 제거할 수 있기 때문에, 재조합 코리네박테리움의 산업적 활용에 매우 유용하다.