본 발명은 헤어핀 자기조립을 이용하여 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 헤어핀 자기조립 기반의 신호증폭을 통해 RNase H 활성을 표지 없이 고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 방법은 형광 및 소광제 물질 표지를 필요로 하지 않고, 검출 시스템의 낮은 안정성으로 인한 착오 신호 문제가 발생하지 않기 때문에, 보다 저렴하고 간편하게 안정적 및 고감도로 RNase H 활성 검출이 가능하며, 에이즈 (AIDS) 치료제로서 잠재성을 갖는 RNase H 활성저해제의 선별도 가능하다.