본 발명은 조성물이 최적화된 배지에서 배양함으로써 인간 배아줄기세포를 중간엽 줄기세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 TGF-β(Transforming growth factor-β), WNT 및 BMP(Bone morphogenic protein) 신호전달 경로를 활성화함으로써 중배엽을 유도한 후, bFGF 및/또는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor beta polypeptide)의 처리에 의해 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 세포기반 치료에 유용한 중간엽 줄기세포를 대량으로 제공하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.중간엽 줄기세포, 중배엽, 인간 배아줄기세포, TGF-β(Transforming growth factor-β), WNT, BMP(Bone morphogenic protein), bFGF, PDGF-BB(Platelet-derived growth factor beta polypeptide)