Development of novel genetic circuit in escherichia coli for screening fumarate-overproducing strain

Abstract

푸마르산은 탄소 네 개의 다이카복실산의 한 종류로서 에스테르수지, 가소제, 식품첨가물, 식품보존제 등을 생산하는데 사용되어 왔다. 또한, 박테리아의 성장에 6탄당의 대안으로 에너지원으로서 사용되기도 하며 푸마르산은 시트르산 회로를 이루는 물질이기도 하다. 현재 푸마르산은 말레산 무수물로부터 화학적으로 합성되어 왔다. 말레산 무수물은 부탄의 산화반응으로 얻어지는 물질으로서 이렇게 석유로부터 생산되는 경로는 환경 오염 문제를 야기해왔다. 이를 대체하기 위해 산업생명공학기술의 일환으로 대장균을 포함한 여러 미생물에서의 푸마르산 생산이 연구되어 왔으며 이는 현재 화학적인 합성 경로에 비해 경제적인 이점을 지니고 있다. 본 논문에서는 푸마르산을 대량 생산할 수 있는 대장균 균주를 발굴하기 위해 고성능 발굴 시스템을 구축하고자 하였다. 현재로서는 각각의 균주를 푸마르산 생산 조건하에 배양 후 그 배양액의 푸마르산 농도를 액체 크로마토그래프를 이용해 직접 측정하는 방법 밖에 존재하지 않는다. 이는 시간이나 비용적 측면에서 새로운 균주 발굴에 효율적이지 않으며 본 논문에서는 이러한 한계를 넘고자 푸마르산에 반응하는 유전자 회로를 개발하였다. 유전자 회로란 미생물 안에서 특정 화학 물질 등의 환경 변화에 반응해 작동하는 회로로서 전자 회로의 특징을 모사한 것이다. 푸마르산에 반응하는 유전자 회로를 구축하기 위해 다이카복실산을 흡수하는 대장균의 막 간 수송 단백질의 촉진유전자에 보고 단백질로 녹색 형광 단백질 유전자를 결합하였다. 이렇게 구축된 유전자 회로 시스템은 대장균에서 외부에서 넣어준 푸마르산의 농도에 비례하게 형광을 나타내었다. 푸마르산을 넣어준 배양액의 형광을 직접 측정하거나 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter: FACS)에도 적용되는 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 푸마르산 생산을 위해 개량된 대장균 균주에 본 유전자 회로를 넣어주었을 때 균주로부터 생산되는 푸마르산의 양에 비례한 정밀하게 증가하는 형광이 확인되었다. 이를 토대로 푸마르산 대량 생산을 위해 효소의 활성 개량 방법을 택했고, 푸마르산 생산에 관여하는 두 효소 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈와 숙신산 탈수소효소가 선택되었다. 각각의 효소의 발현 시스템이 구축되었고 푸마르산 생산 균주 안에서 앞서 구축한 유전자 회로와 함께 효소들을 발현시켰을 때 형광이 증가함이 확인되었다. 본 연구를 통해 구축된 푸마르산 반응 유전자 회로는 푸마르산 대량 생산을 위한 고성능의 효소 개발 및 균주 발굴을 수행할 수 있는 훌륭한 시스템이 될 것이다.