Glycosphingolipids 생합성 저해를 통한 CHO 세포에서 재조합 EPO의 시알산 증진

Abstract

많은 연구들에서 조혈모세포 자극인자(EPO)의 수용성,분비,생체 내 대사과정에 영향을 미치는 N-당쇄의 중요성이 보고되어져 왔다. 특히, 인간유래재조합 EPO의 당쇄말단 시알산의 함량은 약리활성학에서 가장 중요한 요인이다. 당쇄말단의 시알산의 제거는 생체 내 반감기와 생리활성의 상당한 감소와 연관된다. 따라서, rhEPO의 완전한 tetra-antennary 구조와 tetra-sialyalted된 N-당쇄는 높은 품질의 EPO를 생산하기 위한 가장 중요한 목표이다. Glycosphingolipids(GSLs)는 세포막에 많이 존재하며, 시알산과 같은 다양한 당 구성요소들을 포함한다. 시알산의 전구체인 CMP-sialic acid는 CMP-sialic acid synthase에 의해 합성되어 골지체로 수송된다. 이후, CMP-sialic acid는 GSLs과 당단백질들의 시알산화에 사용된다. 만일 GSLs의 생합성이 억제된다면, 사용되지 않은 CMP-sialic acid는 EPO를 포함하는 당단백질들의 시알산화의 증가를 유도할 것이다. 따라서, 이 연구에서는 CHO세포에서 rhEPO의 시알산화를 증가시키기 위하여 경쟁적 저해제의 처리와 siRNA의 도입을 통하여 GSLs의 생합성을 저해시켰다. ceramide glucosyltransferase(CGT)의 경쟁적 저해제인 EtDO-P4는 GSLs 합성의 가장 첫 단계를 방해하기 위하여 EC2-1H9 세포에 처리되었다. EtDO-P4가 처리된 CHO세포에서 GSLs와 EPO의 시알산화의 분석결과, EtDO-P4의 처리가 주요 GSLs의 발현을 상당히 저해시켰으며 EtDO-P4를 처리하지 않은 세포에 비해 EPO 시알산의 lectin blotting intensity를 약 22% 증가시켰다는 것을 보여주었다. siRNA는 상보적인 핵산 염기 서열의 특정 유전자의 발현을 일시적으로 방해한다. 따라서, 이 연구에서는 CGT의 mRNA 염기서열을 확보하여 siRNA를 제작하였다. 본 연구에서는 GSLs의 생합성이 siRNA 처리에 의하여 상당히 감소하였음을 보여주었다. EPO의 시알산화 함량 분석을 위한 lectin blotting에서, siRNA가 처리된 CHO세포의 band intensity가 처리되지 않은 세포에 비하여 약 20% 증가하였다. siRNA의 일시적인 발현때문에, CHO세포에서 안정적으로 siRNA를 생산할 수 있는 발현 벡터의 사용이 필요하다. 따라서, 본 연구에서는 pCGT-miR이라는 shRNA 벡터를 제작하였고 CHO 세포내로 도입시켰다. RT-PCR과 TLC 분석에서, pCGT-miR의 도입은 CGT유전자 발현과 GSL의 발현의 억제에 효과가 있음을 보여주었다. 또한, shRNA가 도입된 CHO세포에서의 rhEPO의 시알산화 역시 control CHO 세포와 비교하였을 때 약 21.6% 증가하였다.